chromatografia, zwana także „analizą chromatograficzną”, „chromatografią”, jest metodą rozdzielania i analizy, która ma bardzo szerokie zastosowanie w chemii analitycznej, chemii organicznej, biochemii i innych dziedzinach.
Założycielem chromatografii jest rosyjski botanik M.Tsvetter.W 1906 roku rosyjski botanik Zvetter opublikował wyniki swojego eksperymentu: W celu oddzielenia pigmentów roślinnych do szklanej rurki zawierającej sproszkowany węglan wapnia wlał ekstrakt eteru naftowego zawierający pigmenty roślinne i eluował go eterem naftowym od góry do dołu.Ponieważ różne pigmenty mają różną zdolność adsorpcji na powierzchni cząstek węglanu wapnia, w procesie ługowania różne pigmenty przemieszczają się w dół z różną prędkością, tworząc w ten sposób pasma o różnych kolorach.Oddzielono składniki pigmentu.Nazwał tę metodę rozdzielania chromatografią.
Schematyczne przedstawienie eksperymentu separacji pigmentu liści roślin
Wraz z ciągłym rozwojem metod separacji przedmiotem separacji staje się coraz więcej substancji bezbarwnych, chromatografia również stopniowo traciła znaczenie „koloru”, ale nazwa ta jest nadal w użyciu.
Klasyfikacja chromatograficzna
Istotą chromatografii jest proces, w którym rozdzielane cząsteczki są rozdzielane i równoważone pomiędzy fazą stacjonarną i fazą ruchomą.Różne substancje są w różny sposób rozdzielane pomiędzy dwie fazy, co powoduje, że poruszają się one z różną prędkością w fazie ruchomej.Wraz z ruchem fazy ruchomej różne składniki mieszaniny oddzielają się od siebie na fazie stacjonarnej.W zależności od mechanizmu można go podzielić na różne kategorie.
1, zgodnie z dwufazową klasyfikacją stanu fizycznego
Faza ruchoma: chromatografia gazowa, chromatografia cieczowa, chromatografia cieczowa w stanie nadkrytycznym
Faza stacjonarna: gaz-ciało stałe, gaz-ciecz;Ciecz-ciało stałe, ciecz-ciecz
2, zgodnie z formą klasyfikacji fazy stacjonarnej
Chromatografia kolumnowa: chromatografia kolumnowa z wypełnieniem, chromatografia kolumnowa kapilarna, chromatografia kolumnowa z mikropakowaniem, chromatografia preparatywna
Chromatografia płaszczyznowa: chromatografia bibułowa, chromatografia cienkowarstwowa, chromatografia na membranach polimerowych
3, sklasyfikowane według mechanizmu separacji
Chromatografia adsorpcyjna: Różne składniki rozdziela się według ich zdolności adsorpcji i desorpcji na adsorbentach
Chromatografia podziału: Różne składniki rozdziela się w zależności od ich rozpuszczalności w rozpuszczalniku
Chromatografia wykluczania molekularnego: w zależności od wielkości cząsteczki w separacji. Chromatografia jonowymienna: różne składniki powinowactwa do separacji na żywicy jonowymiennej.
Chromatografia powinowactwa: Rozdział na podstawie obecności określonego powinowactwa pomiędzy makrocząsteczkami biologicznymi
Elektroforeza kapilarna: składniki rozdzielono w zależności od różnic w mobilności i/lub zachowaniu podziału
Chromatografię chiralną stosuje się do rozdzielania i analizy leków chiralnych, które można podzielić na trzy kategorie: metoda chiralnego odczynnika derywatyzującego;Metoda addytywna z chiralną fazą ruchomą;Metoda rozdziału chiralnej fazy stacjonarnej
Podstawowa terminologia dotycząca chromatografii
Krzywe otrzymane poprzez wykreślenie sygnałów odpowiedzi składników po wykryciu rozdziału chromatograficznego w funkcji czasu nazywane są chromatogramami.
Wartość bazowa:W pewnych warunkach chromatograficznych krzywa sygnału generowanego, gdy przez układ detektora przechodzi tylko faza ruchoma, nazywana jest linią bazową, jak pokazano na linii t.Gdy warunki eksperymentu były stabilne, linią bazową była linia równoległa do osi poziomej.Linia bazowa odzwierciedla szum instrumentu, głównie detektora, w czasie.
Wysokość szczytu:odległość pionowa pomiędzy punktem piku chromatograficznego a linią bazową, oznaczona jako h, jak pokazano na linii AB.
Szerokość regionu:Szerokość obszaru piku chromatograficznego jest bezpośrednio związana ze skutecznością rozdzielania.Istnieją trzy metody opisu szerokości piku chromatograficznego: odchylenie standardowe σ, szerokość piku W i FWHM W1/2.
Odchylenie standardowe (σ):σ jest połową odległości między dwoma punktami przegięcia na krzywej rozkładu normalnego, a wartość σ wskazuje stopień rozproszenia składników od kolumny.Im większa wartość σ, tym bardziej rozproszone są składniki ścieków i tym gorszy efekt separacji.I odwrotnie, składniki ścieków są skoncentrowane, a efekt separacji jest dobry.
Szerokość piku W:Punkty przecięcia po obu stronach piku chromatograficznego są używane jako linie styczne, a punkt przecięcia na linii podstawowej nazywany jest szerokością piku lub szerokością linii bazowej, co można również wyrazić jako W, jak pokazano na rysunku IJ.Zgodnie z zasadą rozkładu normalnego można wykazać, że związek między szerokością piku a odchyleniem standardowym wynosi W=4σ.
W1/2:Szerokość piku w połowie wysokości piku nazywa się FWHM, jak pokazano dla odległości GH.W1/2=2,355σ, W=1,699W1/2.
Obydwa W1/2, W pochodzą z σ i służą do obliczania powierzchni pików oprócz pomiaru efektu kolumny.Pomiar FWHM jest wygodniejszy i najczęściej stosowany.
krótkie podsumowanie
Na podstawie krzywej wypływu piku chromatograficznego można osiągnąć następujące cele:
a, Analizę jakościową przeprowadzono w oparciu o wartość retencji pików chromatograficznych
b, analiza ilościowa oparta na powierzchni lub piku piku chromatograficznego
C. Skuteczność rozdzielania kolumny oceniano na podstawie wartości retencji i szerokości piku chromatograficznego
Wzór obliczeniowy stosowany w chromatografii
1. Wartość utrzymania
Wartość retencji jest parametrem używanym do opisania stopnia zatrzymania składnika próbki w kolumnie i służy jako wskaźnik charakterystyki chromatograficznej.Sposób jego reprezentacji jest następujący:
Czas retencji tR
Czas zgonutM
Dostosuj czas retencji tR'=tR-tM
(Całkowity czas spędzony w fazie stacjonarnej)
Objętość retencji
VR=tR*F.(niezależna od prędkości fazy ruchomej)
Martwy wolumen
VM=tM*Fc
(Przestrzeń nie zajmowana przez fazę stacjonarną na drodze przepływu od wtryskiwacza do detektora)
Dostosuj głośność przechowywania VR'=t'R*Fc
2. Względna wartość retencji
Względna wartość retencji, znana również jako współczynnik separacji, współczynnik podziału lub względny współczynnik pojemności, to stosunek skorygowanego czasu retencji (objętości) badanego składnika do dostosowanego czasu retencji (objętości) wzorca w określonych warunkach chromatograficznych.
Względne wartości retencji zastosowano w celu wyeliminowania wpływu pewnych warunków pracy, takich jak natężenie przepływu i utrata utrwalacza, na wartości retencji.Wzorcem względnej wartości retencji może być składnik badanej próbki lub związek dodany sztucznie.
3. Wskaźnik retencji
Wskaźnik retencji to wskaźnik retencji badanej substancji i w ustalonym roztworze X. Jako substancje odniesienia wybiera się dwa n-alany, z których jeden ma liczbę atomów węgla N, a drugi N+n.Ich skorygowany czas retencji wynosi odpowiednio t 'r (N) i t 'r (N+n), tak że skorygowany czas retencji t'r (i) badanej substancji i jest dokładnie pomiędzy nimi, tj. t 'r (N).
Wskaźnik retencji można obliczyć w następujący sposób.
4. Współczynnik wydajności (k)
W równowadze stosunek masy składnika w fazie stacjonarnej (fazie) do fazy ruchomej (m), nazywany współczynnikiem wydajności.Formuła jest następująca:
5. Współczynnik podziału (K) W równowadze, stosunek stężenia składnika w fazie stacjonarnej (fazach) do fazy ruchomej (m), zwany współczynnikiem podziału.Formuła jest następująca
Związek pomiędzy K i k:
Odzwierciedla typ kolumny i jej węzeł, ważne właściwości konstrukcji
krótkie podsumowanie
Zależność między wartością retencji a współczynnikiem pojemności i współczynnikiem podziału:
Rozdział chromatograficzny opiera się na różnicy w zdolności adsorpcji lub rozpuszczania każdego składnika w ustalonej względnej próbce, którą można ilościowo wyrazić wielkością wartości współczynnika podziału K (lub współczynnika wydajności k).
Składniki o silnej zdolności adsorpcji lub rozpuszczania mają duży współczynnik podziału (lub współczynnik pojemności) i długi czas retencji.I odwrotnie, składniki o słabej adsorpcji lub rozpuszczalności mają mały współczynnik podziału i krótki czas retencji.
Podstawowa teoria chromatografii
1. Teoria tac
(1) Przedstaw -- teoria termodynamiczna
Zaczęło się od modelu płyty wieżowej zaproponowanego przez Martina i Synge.
Kolumna frakcjonująca: na tacy przez kilka razy równowaga gaz-ciecz, zgodnie z temperaturą wrzenia różnych separacji.
Kolumna: Składniki są zrównoważone przez wiele podziałów pomiędzy dwiema fazami i rozdzielone według różnych współczynników podziału.
(2) Hipoteza
(1) W kolumnie znajduje się wiele tac, a składniki mogą szybko osiągnąć równowagę dystrybucji w obrębie odstępu tac (tj. wysokości tacy).
(2) Faza ruchoma wchodzi do kolumny nie w sposób ciągły, ale pulsacyjnie, to znaczy każde przejście stanowi objętość kolumny.
(3) Gdy próbkę dodano do każdej płytki kolumny, można pominąć dyfuzję próbki wzdłuż osi kolumny.
(4) Współczynnik podziału jest równy na wszystkich tacach, niezależnie od ilości składników.Oznacza to, że współczynnik podziału jest stały na każdym tabanie.
(3) Zasada
Schematyczny diagram teorii tacek
Jeżeli na tackę nr 0 dodamy składnik masy jednostkowej, czyli m=1 (np. 1mg lub 1µg), to po rozdzieleniu nastąpi równowaga, bo k=1, czyli ns=nm, nm=ns=0,5.
Kiedy objętość płyty (lΔV) gazu nośnego wpływa do płyty 0 w postaci pulsacji, gaz nośny zawierający składnik nm w fazie gazowej jest wypychany do płyty 1. W tym momencie składnik ns w fazie ciekłej płyty 0 a składnik nm w fazie gazowej płyty 1 zostanie ponownie rozdzielony pomiędzy dwiema fazami.Zatem całkowita ilość składników zawartych na płycie 0 wynosi 0,5, przy czym fazy gazowa i ciekła stanowią po 0,25, a całkowita ilość zawarta na płycie 1 również wynosi 0,5.Ilość faz gazowej i ciekłej również wynosiła 0,25.
Proces ten powtarza się za każdym razem, gdy do kolumny wprowadza się pulsację gazu nośnego o nowej objętości płyty (patrz tabela poniżej).
(4)Równanie chromatograficznej krzywej wypływu
σ to odchylenie standardowe, to czas retencji, C to stężenie w dowolnym momencie,
C, to stężenie wtrysku, czyli całkowita ilość składników (powierzchnia piku A).
(5) parametry wydajności kolumny
Przy stałym tR im mniejszy W lub w 1/2 (czyli węższy pik), tym większa liczba teoretycznych półek n, tym mniejsza teoretyczna wysokość półki i tym wyższa skuteczność separacji kolumny.To samo dotyczy efektywnej teorii tacy neff.Dlatego teoretyczna liczba tac jest wskaźnikiem do oceny wydajności kolumn.
(5) Charakterystyka i wady
> Zalety
Teoria tac ma charakter półempiryczny i wyjaśnia kształt krzywej odpływu
Zilustrowano procesy podziału i separacji składników
Zaproponowano wskaźnik do oceny wydajności kolumny
> Ograniczenia
Składniki nie mogą tak naprawdę osiągnąć równowagi dystrybucji w dwóch fazach:
Nie można zignorować dyfuzji wzdłużnej składników w kolumnie:
Nie uwzględniono wpływu różnych czynników kinetycznych na proces przenoszenia masy.
Nie można wyjaśnić związku między efektem kolumnowym a prędkością przepływu fazy ruchomej:
Nie jest jasne, jakie główne czynniki wpływają na efekt kolumny
Problemy te są zadowalająco rozwiązane w teorii stopy procentowej.
2. Teoria stóp
W 1956 roku holenderski uczony VanDeemter i in.zaabsorbował koncepcję teorii tacki i połączył czynniki kinetyczne wpływające na wysokość tacki, przedstawił kinetyczną teorię procesu chromatograficznego - teorię szybkości i wyprowadził równanie VanDeemtera.Traktuje proces chromatograficzny jako dynamiczny proces nierównowagowy i bada wpływ czynników kinetycznych na poszerzenie piku (tj. efekt kolumnowy).
Później Giddings i Snyder i in.zaproponował równanie szybkości chromatografii cieczowej (mianowicie równanie Giddingsa) oparte na równaniu VanDeemtera (później zwanym równaniem szybkości chromatografii gazowej) i zgodnie z różnicą właściwości cieczy i gazu.
(1) Równanie Van Deemtera
Gdzie: H: to wysokość deski
A: współczynnik dyfuzji wirowej
B: współczynnik dyfuzji molekularnej
C: współczynnik oporu przenoszenia masy
(2) Równanie Giddingsa
Analiza ilościowa i jakościowa
(1) Analiza jakościowa
Jakościowa analiza chromatograficzna ma na celu określenie związków reprezentowanych przez każdy pik chromatograficzny.Ponieważ różne substancje mają określone wartości retencji w określonych warunkach chromatograficznych, wartość retencji można wykorzystać jako wskaźnik jakościowy.Różne chromatograficzne metody jakościowe opierają się obecnie na wartościach retencji.
Jednakże różne substancje mogą mieć podobne lub identyczne wartości retencji w tych samych warunkach chromatograficznych, to znaczy wartości retencji nie są wyłączne.Dlatego trudno jest scharakteryzować zupełnie nieznaną próbkę na podstawie samych wartości retencji.Jeżeli na podstawie zrozumienia źródła, charakteru i przeznaczenia próbki można dokonać wstępnej oceny składu próbki i zastosować następujące metody w celu określenia związku reprezentowanego przez pik chromatograficzny.
1. Kontrola jakościowa przy użyciu substancji czystych
W pewnych warunkach chromatograficznych niewiadoma ma tylko określony czas retencji.Dlatego niewiadomą można zidentyfikować jakościowo, porównując czas retencji znanej czystej substancji w tych samych warunkach chromatograficznych z czasem retencji nieznanej substancji.Jeżeli są one takie same, nieznana substancja może być znaną czystą substancją;W przeciwnym razie nieznane nie jest czystą substancją.
Metodę kontroli czystej substancji można zastosować wyłącznie do nieznanej substancji, której skład jest znany, której skład jest stosunkowo prosty i której czysta substancja jest znana.
2. Metoda względnej wartości retencji
Względna wartość retencji α odnosi się do dopasowania pomiędzy składnikiem i a materiałami odniesienia. Stosunek wartości retencji:
Zmienia się jedynie wraz ze zmianą temperatury utrwalacza i kolumny i nie ma nic wspólnego z innymi warunkami pracy.
W określonej temperaturze fazy stacjonarnej i kolumny mierzy się odpowiednio skorygowane wartości retencji składnika i i substancji odniesienia s, a następnie oblicza je według powyższego wzoru.Uzyskane względne wartości retencji można jakościowo porównać z odpowiednimi wartościami w literaturze.
3, dodawanie znanych substancji w celu zwiększenia metody wysokości piku
Gdy w nieznanej próbce znajduje się wiele składników, uzyskane piki chromatograficzne są zbyt gęste, aby można je było łatwo zidentyfikować powyższą metodą, lub gdy nieznana próbka jest używana wyłącznie do analizy określonego elementu.
„Najpierw wykonuje się chromatogram nieznanej próbki, a następnie uzyskuje się kolejny chromatogram przez dodanie znanej substancji do nieznanej próbki”.W przypadku takich substancji mogą być znane składniki o zwiększonej wysokości pików.
4. Zachowaj jakościową metodę wskaźnika
Wskaźnik retencji reprezentuje zachowanie substancji w utrwalaczach i jest obecnie najpowszechniej stosowanym i uznanym na arenie międzynarodowej wskaźnikiem jakościowym w GC.Ma zalety dobrej powtarzalności, jednolitego standardu i małego współczynnika temperaturowego.
Wskaźnik retencji jest powiązany jedynie z właściwościami fazy stacjonarnej i temperaturą kolumny, ale nie z innymi warunkami doświadczalnymi.Jego dokładność i powtarzalność są doskonałe.Dopóki temperatura kolumny jest taka sama jak temperatura fazy stacjonarnej, do identyfikacji można zastosować wartość literaturową, bez konieczności stosowania do porównania czystego materiału.
(2)Analiza ilościowa
Podstawa kwantyfikacji chromatograficznej:
Zadaniem analizy ilościowej jest znalezienie stu składników w zmieszanej próbce
Treść ułamkowa.Kwantyfikację chromatograficzną przeprowadzono w następujący sposób: gdy warunki pracy były spójne, było
Masę (lub stężenie) mierzonego składnika określa się na podstawie sygnału odpowiedzi podawanego przez detektor
To jest proporcjonalne.Mianowicie:
Podstawa kwantyfikacji chromatograficznej:
Zadaniem analizy ilościowej jest znalezienie stu składników w zmieszanej próbce
Treść ułamkowa.Kwantyfikację chromatograficzną przeprowadzono w następujący sposób: gdy warunki pracy były spójne, było
Masę (lub stężenie) mierzonego składnika określa się na podstawie sygnału odpowiedzi podawanego przez detektor
To jest proporcjonalne.Mianowicie:
1. Metoda pomiaru powierzchni pików
Powierzchnia piku to podstawowe dane ilościowe dostarczane przez chromatogramy, a dokładność pomiaru powierzchni piku ma bezpośredni wpływ na wyniki ilościowe.Zastosowano różne metody pomiaru pików chromatograficznych o różnych kształtach pików.
W analizie ilościowej trudno jest znaleźć dokładną wartość zimy:
Z jednej strony ze względu na trudność dokładnego pomiaru bezwzględnej objętości wtrysku: z drugiej strony
Powierzchnia piku zależy od warunków chromatograficznych i podczas pomiaru wartości należy zachować pasek chromatograficzny
Robienie tego samego nie jest ani możliwe, ani wygodne.I nawet jeśli uda ci się to zrobić dobrze
Dokładna wartość, również dlatego, że nie ma jednolitego standardu i nie można go bezpośrednio zastosować.
2.Ilościowy współczynnik korygujący
Definicja ilościowego współczynnika korekcyjnego: ilość składników wchodzących do detektora (m)
Stosunek powierzchni piku chromatograficznego (A) lub wysokości piku () jest stałą proporcjonalności (,
Stała proporcjonalności nazywana jest bezwzględnym współczynnikiem korekcji składnika.
W analizie ilościowej trudno jest znaleźć dokładną wartość zimy:
Z jednej strony ze względu na trudność dokładnego pomiaru bezwzględnej objętości wtrysku: z drugiej strony
Powierzchnia piku zależy od warunków chromatograficznych i podczas pomiaru wartości należy zachować pasek chromatograficzny
Robienie tego samego nie jest ani możliwe, ani wygodne.I nawet jeśli uda ci się to zrobić dobrze
Dokładna wartość, również dlatego, że nie ma jednolitego standardu i nie można go bezpośrednio zastosować.
Oznacza to, że względnym współczynnikiem korygującym komponentu jest komponent i materiał odniesienia
Stosunek bezwzględnych współczynników korygujących.
Można zauważyć, że względny współczynnik korygujący ma miejsce wtedy, gdy jakość komponentu jest porównywana ze standardem.
Jeżeli substancja s jest równa, powierzchnia piku materiału odniesienia jest powierzchnią piku składnika
Wiele.Jeśli jakiś składnik ma masę m i powierzchnię piku A, to liczba f'A
Wartości są równe powierzchni piku materiału odniesienia o masie .Innymi słowy,
Dzięki względnemu współczynnikowi korekcji można oddzielić obszary pików każdego składnika
Przeliczane na powierzchnię piku materiału odniesienia równą jego masie, a następnie stosunek
Norma jest ujednolicona.Jest to więc znormalizowana metoda obliczania procentu każdego składnika
Podstawa ilości.
Metoda uzyskania względnego współczynnika korygującego: wartości względnego współczynnika korygującego porównano jedynie z wartościami będącymi
Pomiar zależy od standardu i rodzaju czujki, ale od listwy sterującej
To nie ma znaczenia.Dlatego wartości można uzyskać z odniesień w literaturze.Jeśli tekst
Jeśli nie możesz znaleźć w ofercie pożądanej wartości, możesz ją również ustalić samodzielnie.Metoda oznaczania
Metoda: Pewna ilość mierzonej substancji, wybrany materiał odniesienia → doprowadzona do określonego stężenia
Zmierzono powierzchnie pików chromatograficznych A i As dwóch składników.
Taka jest formuła.
3. Ilościowa metoda obliczeń
(1) Metoda normalizacji powierzchni
Sumę zawartości wszystkich frakcji wolnych od pików obliczono jako 100% w celu oznaczenia ilościowego
Metoda ta nazywa się normalizacją.Jego wzór obliczeniowy jest następujący:
Gdzie P,% oznacza procentową zawartość badanych składników;A1, A2... An jest składnikiem 1. Powierzchnia piku 1~n;f'1, f'2... f'n jest względnym współczynnikiem korygującym dla składowych od 1 do n.
(2) metoda standardu zewnętrznego
Metoda ilościowego porównania sygnału odpowiedzi badanego składnika w próbce i czystego składnika badanego jako kontroli.
(3) Metoda standardu wewnętrznego
Tak zwana metoda wzorca wewnętrznego to metoda, w której do roztworu mianowanego substancji badanej i roztworu próbki jako wzorca wewnętrznego dodaje się pewną ilość czystej substancji, a następnie poddaje się ją analizie i oznaczeniu.
(3)standardowa metoda dodawania
Standardowa metoda dodawania, znana również jako metoda dodawania wewnętrznego, polega na dodaniu określonej ilości (△C)
Odniesienie substancji testowej dodano do badanego roztworu próbki, a test dodano do testu
Pik roztworu próbki po substancji był wyższy niż pik pierwotnego roztworu próbki
Do obliczenia stężenia substancji w roztworze próbki wykorzystano przyrost pola powierzchni (△A).
Treść (Cx)
Gdzie Ax jest powierzchnią piku mierzonej substancji w pierwotnej próbce.
Czas publikacji: 27 marca 2023 r