Zasady i metody analizy ilościowej metodą chromatografii cieczowej

Mechanizm rozdziału w chromatografii cieczowej opiera się na różnicy w powinowactwie składników mieszaniny do dwóch faz.

Według różnych faz stacjonarnych chromatografia cieczowa dzieli się na chromatografię ciecz-ciało stałe, chromatografię ciecz-ciecz i chromatografię w fazie związanej.Najpowszechniej stosowane są chromatografia ciecz-ciało stałe z żelem krzemionkowym jako wypełniaczem i chromatografia w fazie związanej z mikrokrzemionką jako matrycą.

Ze względu na postać fazy stacjonarnej chromatografię cieczową można podzielić na chromatografię kolumnową, chromatografię bibułową i chromatografię cienkowarstwową.Zgodnie ze zdolnością adsorpcji można ją podzielić na chromatografię adsorpcyjną, chromatografię podziału, chromatografię jonowymienną i chromatografię żelowo-permeacyjną.

W ostatnich latach do układu chromatografii kolumnowej cieczowej dodano wysokociśnieniowy układ przepływu cieczy, aby zapewnić szybki przepływ fazy ruchomej pod wysokim ciśnieniem, co poprawia efekt separacji, dzięki czemu wysokowydajna (znana również jako wysokociśnieniowa) chromatografia cieczowa wyłonił się.

CZĘŚĆ
01 Zasada analizy ilościowej chromatografii cieczowej

Aby określić ilościowo na podstawie jakości, jako standardy wymagane są czyste substancje;

Kwantyfikacja za pomocą chromatografii cieczowej jest metodą stosunkowo ilościową: to znaczy ilość analitu w mieszaninie jest szacowana na podstawie znanej ilości czystej próbki wzorcowej

CZĘŚĆ
02 Podstawy oznaczania ilościowego metodą chromatografii cieczowej

Ilość mierzonej składowej (W) jest proporcjonalna do wartości odpowiedzi (A) (wysokość piku lub powierzchnia piku), W=f×A.

Ilościowy współczynnik korygujący (f): Jest to stała proporcjonalności wzoru obliczenia ilościowego, a jego fizyczne znaczenie to ilość mierzonego składnika reprezentowana przez wartość odpowiedzi jednostkowej (powierzchnia szczytowa).

Ilościowy współczynnik korygujący można uzyskać ze znanej ilości próbki standardowej i jej wartości odpowiedzi.

Zmierz wartość odpowiedzi nieznanego składnika, a ilość składnika można uzyskać za pomocą ilościowego współczynnika korygującego.

CZĘŚĆ
03 Powszechne terminy w analizie ilościowej

Próbka (próbka): roztwór zawierający analit do analizy chromatograficznej.Podział na próbki standardowe i nieznane.

Standard: Czysty produkt o znanym stężeniu.Próbka nieznana (nieznana): Mieszanina, której stężenie ma być badane.

Masa próbki: Pierwotne ważenie badanej próbki.

Rozcieńczenie: Współczynnik rozcieńczenia nieznanej próbki.

Składnik : pik chromatograficzny przeznaczony do analizy ilościowej, to znaczy analit, którego zawartość jest nieznana.

Ilość składnika (ilość): zawartość (lub stężenie) badanej substancji.

Całkowitość: Proces obliczeniowy pomiaru powierzchni piku chromatograficznego za pomocą komputera.

Krzywa kalibracji: Liniowa krzywa zawartości składnika w funkcji wartości odpowiedzi, ustalona na podstawie znanej ilości substancji wzorcowej, stosowana do określenia nieznanej zawartości analitu.

CZĘŚĆ
04 Analiza ilościowa chromatografii cieczowej

1. Wybierz metodę chromatograficzną odpowiednią do analizy ilościowej:

l Potwierdź szczyt wykrytego składnika i uzyskaj rozdzielczość (R) większą niż 1,5

l Określić konsystencję (czystość) pików chromatograficznych badanych składników

l Określ granicę wykrywalności i granicę oznaczalności metody;czułość i zakres liniowy

2. Ustal krzywą kalibracyjną przy użyciu próbek wzorcowych o różnych stężeniach

3. Sprawdzać dokładność i precyzję metod ilościowych

4. Użyj odpowiedniego oprogramowania do zarządzania chromatografią, aby wdrożyć pobieranie próbek, przetwarzanie danych i raportowanie wyników

CZĘŚĆ
05 Identyfikacja pików ilościowych (jakościowych)

Jakościowo zidentyfikuj każdy pik chromatograficzny, który ma być określony ilościowo

Najpierw należy użyć próbki wzorcowej do określenia czasu retencji (Rt) piku chromatograficznego, który ma być określony ilościowo.Porównując czas retencji, znajdź składnik odpowiadający każdemu pikowi chromatograficznemu w nieznanej próbce.Chromatograficzna metoda jakościowa polega na porównaniu czasu retencji z próbką standardową.Kryterium Niewystarczającedalsze potwierdzenie (jakościowe)

1. Standardowa metoda dodawania

2. Stosować jednocześnie inne metody: inne metody chromatograficzne (zmienić mechanizm, np.: zastosowanie różnych kolumn chromatograficznych), inne detektory (PDA: porównanie widm, przeszukiwanie biblioteki widm; MS: analiza widma masowego, przeszukiwanie biblioteki widm)

3. Inne instrumenty i metody

CZĘŚĆ
06 Potwierdzenie ilościowej spójności pików

Potwierdzić konsystencję piku chromatograficznego (czystość)

Upewnij się, że pod każdym pikiem chromatograficznym znajduje się tylko jeden mierzony składnik

Sprawdź, czy nie występują zakłócenia ze strony współeluujących substancji (zanieczyszczeń)

Metody potwierdzania spójności piku chromatograficznego (czystość)

Porównanie spektrogramów z detektorami fotodiodowymi (PDA).

Identyfikacja piku czystości

2996 Teoria kąta czystości

Metody ilościowe powszechnie stosowane w CZĘŚCI 07

Metoda krzywej standardowej z podziałem na metodę standardu zewnętrznego i metodę standardu wewnętrznego:

1. Metoda wzorca zewnętrznego: najczęściej stosowany w chromatografii cieczowej

Przygotowano serię standardowych próbek o znanych stężeniach, stosując czyste próbki badanych związków jako próbki standardowe.wstrzykiwany do kolumny aż do wartości odpowiedzi (powierzchnia piku).
W pewnym zakresie istnieje dobra liniowa zależność pomiędzy stężeniem próbki wzorcowej a wartością odpowiedzi, czyli W= f×A i powstaje krzywa wzorcowa.

W dokładnie tych samych warunkach doświadczalnych wstrzyknij nieznaną próbkę, aby uzyskać wartość odpowiedzi mierzonego składnika.Na podstawie znanego współczynnika f można wyznaczyć stężenie mierzonego składnika.

Zalety metody wzorca zewnętrznego:prosta obsługa i obliczenia, jest to powszechnie stosowana metoda ilościowa;nie ma potrzeby wykrywania i elucji każdego składnika;wymagana jest próbka standardowa;warunki pomiaru próbki standardowej i próbki nieznanej powinny być spójne;objętość wtrysku powinna być dokładna.

Wady metody standardu zewnętrznego:Wymagane są wysokie warunki eksperymentalne, takie jak czułość detektora, natężenie przepływu i skład fazy ruchomej, którego nie można zmienić;objętość każdego wstrzyknięcia powinna charakteryzować się dobrą powtarzalnością.

2. Metoda wzorca wewnętrznego: dokładne, ale kłopotliwe, najczęściej stosowane w metodach standardowych

Do wzorca dodaje się znaną ilość wzorca wewnętrznego, aby uzyskać standard mieszany i przygotowuje się serię wzorców roboczych o znanym stężeniu.Stosunek molowy wzorca do wzorca wewnętrznego w mieszanym standardzie pozostaje niezmieniony.Wstrzyknąć do kolumny chromatograficznej i przyjąć (powierzchnię piku standardowej próbki/powierzchnię piku wewnętrznej próbki wzorcowej) jako wartość odpowiedzi.Na podstawie liniowej zależności pomiędzy wartością odpowiedzi a stężeniem wzorca roboczego, czyli W= f×A, wyznacza się krzywą wzorcową.

Do nieznanej próbki dodaje się znaną ilość wewnętrznego wzorca i wstrzykuje do kolumny w celu uzyskania wartości odpowiedzi mierzonego składnika.Na podstawie znanego współczynnika f można wyznaczyć stężenie mierzonego składnika.

Charakterystyka metody standardu wewnętrznego:Podczas operacji próbkę i wzorzec wewnętrzny miesza się ze sobą i nastrzykuje do kolumny chromatograficznej, tak długo jak stosunek ilości mierzonego składnika do wzorca wewnętrznego w zmieszanym roztworze jest stały, zmiana objętości próbki nie będzie miało wpływu na wyniki ilościowe..Metoda wzorca wewnętrznego kompensuje wpływ objętości próbki, a nawet fazy ruchomej i detektora, dzięki czemu jest dokładniejsza niż metoda wzorca zewnętrznego.

CZĘŚĆ
08 Czynniki wpływające na wyniki analizy ilościowej

Niska dokładność może być spowodowana przez:

Nieprawidłowa integracja obszaru piku, rozkład próbki lub zanieczyszczenia wprowadzone podczas przygotowania próbki, nieuszczelniona fiolka z próbką, ulatnianie się próbki lub rozpuszczalnika, nieprawidłowe przygotowanie próbki, problemy z wtryskiem próbki, nieprawidłowe przygotowanie wewnętrznego standardu

Możliwe przyczyny niskiej precyzji:

Nieprawidłowa integracja pików, problemy z wtryskiem lub wtryskiwaczem, rozkład próbki lub zanieczyszczenia wprowadzone podczas przygotowania próbki, problemy chromatograficzne, obniżona odpowiedź detektora