Chromatografia cieczowa jest główną metodą badania zawartości każdego składnika i zanieczyszczeń w surowcach, półproduktach, preparatach i materiałach opakowaniowych, jednak dla wielu substancji nie ma standardowych metod, na których można by polegać, dlatego nieuniknione jest opracowanie nowych metod. W rozwoju metod fazy ciekłej kolumna chromatograficzna stanowi rdzeń chromatografii cieczowej, dlatego kluczowy jest wybór odpowiedniej kolumny chromatograficznej. W tym artykule autor wyjaśni, jak wybrać kolumnę do chromatografii cieczowej, biorąc pod uwagę trzy aspekty: ogólne pomysły, rozważania i zakres zastosowania.
A. Ogólne pomysły na dobór kolumn do chromatografii cieczowej
1. Oceń właściwości fizyczne i chemiczne analitu: takie jak struktura chemiczna, rozpuszczalność, stabilność (np. czy łatwo ulega utlenieniu/redukcji/hydrolizie), kwasowość i zasadowość itp., szczególnie kluczowa jest struktura chemiczna czynnik określający właściwości, np. grupa sprzężona ma silną absorpcję w ultrafiolecie i silną fluorescencję;
2. Określić cel analizy: czy wymagana jest wysoka separacja, wysoka wydajność kolumny, krótki czas analizy, wysoka czułość, wysoka odporność na ciśnienie, długa żywotność kolumny, niski koszt itp.;
- Wybierz odpowiednią kolumnę chromatograficzną: poznaj skład, właściwości fizyczne i chemiczne wypełniacza chromatograficznego, takie jak wielkość cząstek, wielkość porów, tolerancja temperatury, tolerancja pH, adsorpcja analitu itp.
- Rozważania dotyczące wyboru kolumn do chromatografii cieczowej
W tym rozdziale omówione zostaną czynniki, które należy wziąć pod uwagę przy wyborze kolumny chromatograficznej z punktu widzenia właściwości fizycznych i chemicznych samej kolumny chromatograficznej. 2.1 Matryca wypełniacza
2.1.1 Matryca z żelu krzemionkowego Matrycą wypełniającą większości kolumn do chromatografii cieczowej jest żel krzemionkowy. Ten typ wypełniacza charakteryzuje się wysoką czystością, niskim kosztem, dużą wytrzymałością mechaniczną i łatwością modyfikacji grup (takich jak wiązania fenylowe, wiązania aminowe, wiązania cyjanowe itp.), ale wartość pH i zakres temperatur, jaki toleruje, są ograniczone: Zakres pH większości wypełniaczy matrycowych z żelu krzemionkowego wynosi od 2 do 8, ale zakres pH specjalnie modyfikowanych faz związanych z żelem krzemionkowym może wynosić nawet od 1,5 do 10, a istnieją również specjalnie modyfikowane fazy związane z żelem krzemionkowym, które są stabilne w niskim pH, taki jak Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, który jest stabilny przy pH 1 do 8; górna granica temperatury matrycy z żelu krzemionkowego wynosi zwykle 60 ℃, a niektóre kolumny chromatograficzne mogą tolerować temperaturę 40 ℃ przy wysokim pH.
2.1.2 Matryca polimerowa Wypełniacze polimerowe to głównie polistyren-diwinylobenzen lub polimetakrylan. Ich zaletą jest to, że tolerują szeroki zakres pH – można je stosować w zakresie od 1 do 14, są też bardziej odporne na wysokie temperatury (mogą sięgać powyżej 80°C). W porównaniu z wypełniaczami C18 na bazie krzemionki, ten typ wypełniacza charakteryzuje się większą hydrofobowością, a makroporowaty polimer jest bardzo skuteczny w oddzielaniu próbek takich jak białka. Jego wadą jest to, że wydajność kolumny jest niższa, a wytrzymałość mechaniczna jest słabsza niż w przypadku wypełniaczy na bazie krzemionki. 2.2 Kształt cząstek
Większość nowoczesnych wypełniaczy HPLC to cząstki kuliste, ale czasami są to cząstki nieregularne. Sferyczne cząstki mogą zapewnić niższe ciśnienie w kolumnie, wyższą wydajność kolumny, stabilność i dłuższą żywotność; w przypadku stosowania faz ruchomych o dużej lepkości (takich jak kwas fosforowy) lub gdy roztwór próbki jest lepki, nieregularne cząstki mają większą powierzchnię właściwą, co bardziej sprzyja pełnemu działaniu obu faz, a cena jest stosunkowo niska. 2.3 Rozmiar cząstek
Im mniejszy rozmiar cząstek, tym wyższa wydajność kolumny i większa separacja, ale gorsza odporność na wysokie ciśnienie. Najczęściej stosowaną kolumną jest kolumna o wielkości cząstek 5 µm; jeśli wymagania dotyczące separacji są wysokie, można wybrać wypełniacz o wielkości 1,5-3 μm, co sprzyja rozwiązaniu problemu separacji niektórych próbek o złożonej matrycy i wieloskładnikowych. UPLC może stosować wypełniacze o grubości 1,5 μm; W kolumnach półpreparatywnych lub preparatywnych często stosuje się wypełniacze o wielkości cząstek 10 µm lub większej. 2.4 Zawartość węgla
Zawartość węgla odnosi się do proporcji fazy związanej na powierzchni żelu krzemionkowego, która jest związana z powierzchnią właściwą i pokryciem fazy związanej. Wysoka zawartość węgla zapewnia dużą pojemność kolumny i wysoką rozdzielczość i jest często stosowana w przypadku złożonych próbek wymagających dużej separacji, ale ze względu na długi czas interakcji między dwiema fazami czas analizy jest długi; Kolumny chromatograficzne o niskiej zawartości węgla mają krótszy czas analizy i mogą wykazywać różną selektywność i są często stosowane do prostych próbek, które wymagają szybkiej analizy, oraz próbek wymagających wysokich warunków fazy wodnej. Ogólnie zawartość węgla w C18 waha się od 7% do 19%. 2.5 Wielkość porów i powierzchnia właściwa
Media adsorpcyjne HPLC to porowate cząstki i większość interakcji zachodzi w porach. Dlatego cząsteczki muszą przedostać się do porów, aby zostać zaadsorbowane i oddzielone.
Wielkość porów i powierzchnia właściwa to dwie uzupełniające się koncepcje. Mały rozmiar porów oznacza dużą powierzchnię właściwą i odwrotnie. Duża powierzchnia właściwa może zwiększyć interakcję między cząsteczkami próbki a związanymi fazami, poprawić retencję, zwiększyć obciążenie próbki i pojemność kolumny oraz separację złożonych składników. Do tego typu wypełniaczy zaliczają się wypełniacze w pełni porowate. Dla osób o wysokich wymaganiach separacyjnych zaleca się wybór wypełniaczy o dużej powierzchni właściwej; mała powierzchnia właściwa może zmniejszyć przeciwciśnienie, poprawić wydajność kolumny i skrócić czas równowagi, co jest odpowiednie do analizy gradientu. Do tego typu wypełniaczy zaliczają się wypełniacze typu core-shell. Zakładając zapewnienie separacji, dla tych, którzy mają wysokie wymagania w zakresie wydajności analizy, zaleca się wybieranie wypełniaczy o małej powierzchni właściwej. 2.6 Objętość porów i wytrzymałość mechaniczna
Objętość porów, znana również jako „objętość porów”, odnosi się do wielkości objętości pustych przestrzeni na cząstkę jednostkową. Może dobrze odzwierciedlać wytrzymałość mechaniczną wypełniacza. Wytrzymałość mechaniczna wypełniaczy o dużej objętości porów jest nieco słabsza niż wypełniaczy o małej objętości porów. Wypełniacze o objętości porów mniejszej lub równej 1,5 mL/g stosuje się najczęściej do separacji HPLC, natomiast wypełniacze o objętości porów większej niż 1,5 mL/g stosuje się głównie do chromatografii wykluczania molekularnego i chromatografii niskociśnieniowej. 2.7 Poziom ograniczenia
Capping może zmniejszyć piki ogonowe spowodowane interakcją między związkami i odsłoniętymi grupami silanolowymi (takimi jak wiązania jonowe między związkami alkalicznymi a grupami silanolowymi, siły van der Waalsa i wiązania wodorowe między związkami kwasowymi a grupami silanolowymi), poprawiając w ten sposób wydajność kolumny i kształt piku . Niezamknięte związane fazy będą dawać inną selektywność w porównaniu z zamkniętymi związanymi fazami, szczególnie w przypadku próbek polarnych.
- Zakres zastosowania różnych kolumn do chromatografii cieczowej
W tym rozdziale opisano zakres zastosowań różnych typów kolumn do chromatografii cieczowej w niektórych przypadkach.
3.1 Kolumna chromatograficzna C18 z odwróconą fazą
Kolumna C18 jest najczęściej stosowaną kolumną z odwróconą fazą, która może spełniać testy zawartości i zanieczyszczeń większości substancji organicznych i ma zastosowanie do substancji średniopolarnych, słabo polarnych i niepolarnych. Typ i specyfikację kolumny chromatograficznej C18 należy dobrać zgodnie ze specyficznymi wymaganiami dotyczącymi separacji. Na przykład w przypadku substancji o wysokich wymaganiach dotyczących separacji często stosuje się specyfikacje 5 μm*4,6 mm*250 mm; w przypadku substancji o złożonych matrycach separacji i podobnej polaryzacji można zastosować specyfikacje 4 μm*4,6 mm*250 mm lub mniejsze rozmiary cząstek. Na przykład autor użył kolumny 3 μm*4,6 mm*250 mm do wykrycia dwóch genotoksycznych zanieczyszczeń w API celekoksybu. Oddzielenie dwóch substancji może osiągnąć 2,9, co jest wynikiem doskonałym. Ponadto, zakładając zapewnienie separacji, jeśli wymagana jest szybka analiza, często wybiera się krótką kolumnę 10 mm lub 15 mm. Na przykład, gdy autor zastosował LC-MS/MS do wykrycia genotoksycznego zanieczyszczenia w API fosforanu piperachiny, zastosowano kolumnę 3 μm*2,1 mm*100 mm. Oddzielenie zanieczyszczeń od głównego składnika wynosiło 2,0, a wykrywanie próbki można zakończyć w ciągu 5 minut. 3.2 Kolumna fenylowa z odwróconą fazą
Kolumna fenylowa jest również rodzajem kolumny z odwróconą fazą. Kolumna tego typu charakteryzuje się dużą selektywnością w stosunku do związków aromatycznych. Jeżeli reakcja związków aromatycznych mierzona zwykłą kolumną C18 jest słaba, można rozważyć wymianę kolumny fenylowej. Na przykład, gdy przygotowywałem API celekoksybu, reakcja głównego składnika zmierzona na kolumnie fenylowej tego samego producenta i tej samej specyfikacji (wszystkie 5 μm*4,6 mm*250 mm) była około 7 razy większa niż w kolumnie C18. 3.3 Kolumna z fazą normalną
Jako skuteczne uzupełnienie kolumny z odwróconą fazą, kolumna z normalną fazą jest odpowiednia dla związków silnie polarnych. Jeżeli pik jest nadal bardzo szybki przy eluowaniu ponad 90% fazą wodną w kolumnie z odwróconą fazą, a nawet jest blisko piku rozpuszczalnika i pokrywa się z nim, można rozważyć wymianę kolumny z normalną fazą. Ten typ kolumny obejmuje kolumnę hiliczną, kolumnę aminową, kolumnę cyjanową itp.
3.3.1 Kolumna Hilic Kolumna Hilic zwykle zawiera grupy hydrofilowe w związanym łańcuchu alkilowym w celu wzmocnienia reakcji na substancje polarne. Kolumna tego typu nadaje się do analizy substancji cukrowych. Autor wykorzystał tego typu kolumny przy opracowywaniu zawartości i substancji pokrewnych ksylozy i jej pochodnych. Izomery pochodnej ksylozy można również dobrze rozdzielić;
3.3.2 Kolumna aminowa i kolumna cyjanowa Kolumna aminowa i kolumna cyjanowa odnoszą się do wprowadzenia modyfikacji aminowych i cyjanowych odpowiednio na końcu związanego łańcucha alkilowego w celu poprawy selektywności w przypadku specjalnych substancji: na przykład kolumna aminowa jest dobrym wyborem do oddzielania cukrów, aminokwasów, zasad i amidów; kolumna cyjanowa ma lepszą selektywność przy oddzielaniu uwodornionych i nieuwodornionych strukturalnie podobnych substancji ze względu na obecność wiązań sprzężonych. Kolumnę aminową i kolumnę cyjanową można często przełączać między kolumną z normalną fazą a kolumną z odwróconą fazą, ale częste przełączanie nie jest zalecane. 3.4 Kolumna chiralna
Kolumna chiralna, jak sama nazwa wskazuje, nadaje się do separacji i analizy związków chiralnych, szczególnie w dziedzinie farmaceutyki. Ten typ kolumny można rozważyć, gdy konwencjonalne kolumny z odwróconą fazą i normalne kolumny z fazą nie pozwalają na rozdzielenie izomerów. Na przykład autor użył chiralnej kolumny 5 μm*4,6 mm*250 mm do rozdzielenia dwóch izomerów 1,2-difenyloetylenodiaminy: (1S,2S)-1,2-difenyloetylenodiaminy i (1R,2R)-1,2 -difenyloetylenodiamina, a rozdział między nimi osiągnął około 2,0. Kolumny chiralne są jednak droższe niż kolumny innych typów, zwykle 1 W+/sztukę. Jeżeli istnieje zapotrzebowanie na takie kolumny, jednostka musi dysponować wystarczającym budżetem. 3.5 Kolumna jonowymienna
Kolumny jonowymienne nadają się do separacji i analizy jonów naładowanych, takich jak jony, białka, kwasy nukleinowe i niektóre substancje cukrowe. Ze względu na rodzaj wypełniacza dzieli się je na kolumny kationowymienne, kolumny anionowymienne i kolumny silnie kationowymienne.
Kolumny kationowymienne obejmują kolumny wapniowe i wodorowe, które nadają się głównie do analizy substancji kationowych, takich jak aminokwasy. Na przykład autor użył kolumn wapniowych do analizy glukonianu wapnia i octanu wapnia w roztworze płuczącym. Obie substancje wykazały silną reakcję przy λ=210nm, a stopień separacji osiągnął 3,0; autor do analizy substancji pochodnych glukozy wykorzystał kolumny wodorowe. Kilka głównych substancji pokrewnych – maltoza, maltotrioza i fruktoza – charakteryzowało się wysoką czułością w detektorach różnicowych, z granicą wykrywalności wynoszącą zaledwie 0,5 ppm i stopniem separacji 2,0–2,5.
Kolumny anionowymienne nadają się głównie do analizy substancji anionowych, takich jak kwasy organiczne i jony halogenowe; mocne kolumny kationowymienne mają wyższą zdolność wymiany jonów i selektywność oraz nadają się do separacji i analizy złożonych próbek.
Powyższe stanowi jedynie wprowadzenie do rodzajów i zakresów zastosowań kilku popularnych kolumn do chromatografii cieczowej w połączeniu z własnym doświadczeniem autora. Istnieją inne specjalne typy kolumn chromatograficznych w rzeczywistych zastosowaniach, takie jak kolumny chromatograficzne o dużych porach, kolumny chromatograficzne o małych porach, kolumny do chromatografii powinowactwa, kolumny do chromatografii wielomodowej, kolumny do ultrawysokosprawnej chromatografii cieczowej (UHPLC), kolumny do chromatografii cieczowej nadkrytycznej ( SFC) itp. Odgrywają ważną rolę w różnych dziedzinach. Konkretny typ kolumny chromatograficznej należy wybrać w zależności od struktury i właściwości próbki, wymagań dotyczących separacji i innych celów.
Czas publikacji: 14 czerwca 2024 r